[Specific detection of Vibrio cholerae in marine ecosystem by a colony hybridization assay after culture on selective medium]
Détection de Vibrio cholerae dans un écosystème marin par hybridation moléculaire après culture sur un milieu sélectif
Abstract
A rapid and efficient molecular method based on culture selective medium and colony hybridization assay was developed to identify V. cholerae in water samples of Rance estuary. A 22 nucleotide sequence of the 16S-23S rDNA region was labeled with digoxigenin and evaluated for specificity and sensitivity by dot blot and colony hybridization with strains from the Collection de l'Institut Pasteur and environmental and clinical isolates of V. cholerae from the collection of the Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra. The probe hybridized with all strains of V. cholerae. No isolates of species other than V. cholerae or other genera hybridized with the probe. This molecular technique allows specific detection of V. cholerae strains in mixed microbial populations from water samples, after enrichment procedure and growth on selective culture media, TCBS agar or mGNA, less selective but favoring the growth of this species. Moreover, this method increases the recovery of V. cholerae (10-fold higher) and can be used for its detection in natural samples after direct plating on mGNA, without prior enrichment. By this way, the laborious classic approach to control bacteria contamination in environmental marine water and seafood could be simplified.
Une technique moléculaire d'hybridation sur colonies bactériennes a été développée pour rechercher les souches de Vibrio cholerae dans l'eau de l'estuaire de la Rance. Une séquence de 22 nucléotides sélectionnée à l'extrémité de la région 16S de l'espace intergénique 16S-23S de l'ADN de V. cholerae a été marquée à la digoxygénine (DIG). La spécificité et la sensibilité de la sonde ont été démontrées d'une part par hybridation avec des souches de V. cholerae provenant de la Collection de l'Institut Pasteur et de la collection du Centre National de Référence des Vibrions et du Choléra, d'autre part par l'absence d'hybridation avec des souches appartenant à 31 autres espèces du genre Vibrio et à 5 autres genres bactériens. L'hybridation sur colonies permet une détection spécifique de V. cholerae dans des échantillons d'eau parmi une population microbienne hétérogène, après enrichissement puis isolement sur milieux sélectifs, la gélose TCBS classiquement utilisée pour la recherche des vibrions ou un milieu mANA, non inhibiteur mais favorisant la croissance de cette espèce. Elle permet aussi de détecter V. cholerae après étalement direct de l'échantillon d'eau sur le milieu GNAm, sans étape préalable d'enrichissement, ce qui améliore la sensibilité de la détection de V. cholerae d'un facteur 10. Cette méthode pourrait s'appliquer à la surveillance microbiologique de l'environnement marin et des produits qui en sont issus.